Parásitos y vectores volumen 15, Número de artículo: 352 (2022) Citar este artículoLas garrapatas (orden Ixodida) son ectoparásitos, vectores y reservorios de muchos agentes infecciosos que afectan a humanos y animales domésticos.Sin embargo, la falta de información sobre la diversidad genómica de las garrapatas deja brechas significativas en la comprensión de la evolución de las garrapatas y las bacterias asociadas.Recolectamos > 20 000 muestras de garrapatas contemporáneas e históricas (hasta 60 años de conservación) que representan una amplia gama de biodiversidad de garrapatas en diversas regiones geográficas de China.La secuenciación metagenómica se realizó en garrapatas individuales para obtener secuencias completas o casi completas del genoma mitocondrial (mt) de 46 especies de garrapatas, entre las cuales se recuperaron por primera vez genomas mitocondriales de 23 especies.Estos nuevos datos de genomas mt ampliaron en gran medida la diversidad de muchos grupos de garrapatas y revelaron cinco especies crípticas.Utilizando los mismos datos de secuencia metagenómica, identificamos bacterias divergentes y abundantes en las garrapatas Haemaphysalis, Ixodes, Dermacentor y Carios, incluidas nueve especies de bacterias patógenas y especies potencialmente nuevas dentro del género Borrelia.También utilizamos estos datos para explorar la relación evolutiva entre las garrapatas y sus bacterias asociadas, revelando un patrón de relación de codivergencia a largo plazo entre las garrapatas y las bacterias Rickettsia y Coxiella.En resumen, nuestro estudio proporciona nueva información importante sobre la diversidad genética de las garrapatas basada en un análisis del ADN mitocondrial, así como sobre la prevalencia de patógenos transmitidos por garrapatas en China.También arroja nueva luz sobre las relaciones evolutivas y ecológicas a largo plazo entre las garrapatas y sus bacterias asociadas.Las garrapatas (Acari: Ixodidae) son artrópodos hematófagos y actúan como vectores de diversos patógenos infecciosos.Las garrapatas se clasifican en tres familias: Argasidae (garrapatas blandas), Ixodidae (garrapatas duras) y Nuttalliellidae.Si bien solo hay una especie existente en Nuttalliellidae, considerada el pariente existente más cercano al linaje ancestral de garrapatas, se han identificado > 700 y 200 especies reconocidas dentro de Ixodidae y Argasidae, respectivamente [1,2,3].China cubre una gran área geográfica y posee una variedad de ecosistemas.Hasta la fecha, se han informado al menos 125 especies de garrapatas de nueve géneros en 34 provincias de China, lo que representa el 13,9 % de las especies de garrapatas identificadas a nivel mundial [4].Las especies reportadas con mayor frecuencia en China son Haemaphysalis longicornis, Dermacentor silvarum, Ixodes persulcatus, Haemaphysalis conicinna, Rhipicephalus microplus y Rhipicephalus sanguineus sensu lato [5, 6].Dermacentor sinicus, Ixodes sinensis, Haemaphysalis tibetensis y Haemaphysalis qinghaiensis solo se han informado en China, aunque faltan datos genómicos para estas especies [7].Los genomas mitocondriales (mt) se utilizan ampliamente en la sistemática molecular porque su tasa relativamente alta de cambio evolutivo proporciona una mayor resolución filogenética a nivel de género o familia [8].Para las garrapatas, hasta la fecha se han secuenciado genomas mt completos que representan 66 especies de 18 géneros [9, 10].En la mayoría de los artrópodos, los genomas mt de garrapatas son circulares, de 14 a 16 kb de longitud y contienen 37 genes, incluidos 13 genes codificadores de proteínas, 22 genes de ARNt y dos genes de ARNr.Los análisis filogenéticos basados ​​en la codificación de proteínas y las secuencias de genes de ARNr muestran una gran coherencia en la clasificación a nivel de género [9].Se ha identificado un solo evento de reordenamiento del genoma en Ixodidae, incluidos los géneros Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma y Haemaphysalis, que poseen una translocación de genes de ARNt (trnL1, trnL2, trnC) y una inversión del gen trnC [11, 12 ].Las garrapatas se han considerado durante mucho tiempo como vectores de enfermedades, con un número creciente de asociaciones de enfermedades humanas descritas en los últimos años [13,14,15,16].Desde 1982, se han identificado más de 30 agentes de enfermedades emergentes transmitidas por garrapatas de al menos 28 especies de garrapatas, que causan una variedad de infecciones humanas, incluidas rickettsiosis, fiebre Q y borreliosis.En conjunto, estos han representado casi 50 000 casos por año desde 2013, según lo informado por el Sistema Nacional de Vigilancia de Enfermedades de Declaración Obligatoria en los EE. UU. [17, 18].Entre estos, la enfermedad por rickettsiosis y la fiebre Q son causadas por dos grupos de bacterias endosimbiontes intracelulares obligadas en las garrapatas: las rickettsias del grupo de la fiebre maculosa (SFG) [19, 20] y Coxiella burnetii [21], albergadas por garrapatas duras y blandas, respectivamente.Por el contrario, las borreliosis, representadas por la enfermedad de Lyme y la fiebre recurrente, son causadas principalmente por bacterias del género Borrelia (phylum Spirochaetes).Las especies de borreliosis de Lyme (LB) (B. burgdorferi) generalmente son transportadas por garrapatas Ixodes, mientras que el grupo de fiebre recurrente Borrelia generalmente es transportado por Ornithodoros sonrai, Ornithodoros erraticus y Ornithodoros moubata [22, 23].Además de los patógenos conocidos, las garrapatas albergan otros simbiontes bacterianos de los géneros Rickettsia y Coxiella.Si bien su importancia para la salud pública sigue sin estar clara, estos microbios son muy frecuentes en las especies de garrapatas y pueden transmitirse a través de los ovarios [24,25,26,27].A pesar del creciente interés en los patógenos transmitidos por garrapatas, nuestro conocimiento de la diversidad genética de las garrapatas en China y las bacterias que portan se limita a una pequeña cantidad de especies comunes.Aquí, recolectamos y secuenciamos 46 especies de garrapatas que representan la biodiversidad de garrapatas en China.Por primera vez que sepamos, revelamos la diversidad genética tanto de las garrapatas como de sus simbiontes bacterianos, lo que permitió un estudio más sistemático de su historia coevolutiva.Entre 1959 y 2019, se recolectaron > 20 000 garrapatas pertenecientes a ocho géneros (Rhipicephalus, Hyalomma, Dermacentor, Amblyomma, Haemaphysalis, Ixodes, Argas y Carios) de diferentes regiones geográficas de China (Fig. 1, Archivo adicional 1: Tabla S1).La mayoría de las garrapatas se recogieron directamente de animales salvajes y domésticos infestados, aunque algunas se capturaron utilizando un método de marcaje por arrastre.Tras la captura, cada garrapata fue sexada e identificada morfológicamente a la especie por biólogos de campo capacitados y luego confirmada mediante la secuenciación de las secuencias del genoma mitocondrial.Entre estas muestras, el 42 % (I. simplex, A. testudinarium y Hae. qinghaiensis) se conservaron en alcohol a temperatura ambiente entre 1 y 60 años, mientras que otras se capturaron vivas y se almacenaron a una temperatura de -80 ℃ hasta la extracción del ADN.Lugares de muestreo de 46 especies de garrapatas recolectadas en China.El mapa de la provincia de Hubei (sombreado en verde) se amplió para mayor claridad.Usamos diferentes colores y formas para representar 46 especies de garrapatas de ocho géneros: Haemaphysalis (rojo), Ixodes (azul oscuro), Dermacentor (amarillo), Rhipicephalus (verde), Amblyomma (azul cielo), Hyalomma (magenta), Argas (púrpura ) y Carios (rosa)Para la mayoría de las muestras, utilizamos un enfoque directo de secuenciación y extracción de ADN total.Para cada muestra, las garrapatas, incluidas las garrapatas inactivas y las garrapatas parcialmente hinchadas, se lavaron primero tres veces en soluciones de PBS antes de homogeneizarlas usando el mezclador Mixer mill MM400 (Restsch).A continuación, los homogeneizados se sometieron a extracción de ADN utilizando el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen) y el kit Mollusc DNA D3373 (OMEGA) siguiendo las recomendaciones del fabricante.Las preparaciones de la biblioteca se realizaron mediante BGI · Tech y/o Novogene y luego se secuenciaron los extremos de los pares de 150 pb en una plataforma Illumina HiSeq 4000.Para dos de las bibliotecas (A3 y A4), las mitocondrias primero se purificaron a partir de homogeneizados de células antes de la extracción de ADN.La preparación de la biblioteca y la secuenciación se realizaron como se describe anteriormente.Para purificar las mitocondrias, los homogeneizados de células se sometieron primero a centrifugación a baja velocidad (10 min a 100 g) para eliminar los desechos insolubles.El sobrenadante se volvió a centrifugar a 10.000 g durante 5 min para obtener las mitocondrias.El total de datos secuenciados generados varió de 0,2 a 30,1 Gbp.Para algunas de las bibliotecas (A41, C7, D23 y C23) donde el genoma mitocondrial recibió una cobertura parcial, aumentamos la profundidad de secuenciación de 4,5 a 12,61 Gbp para obtener una mejor cobertura.Las lecturas de secuencia limpia se ensamblaron de novo utilizando MEGAHIT versión 1.2.6 [28] con parámetros predeterminados.Para obtener las secuencias del genoma mt, los contigs ensamblados se compararon con los genomas mt de referencia en GenBank usando blastn [29].Establecimos el valor E en 1E-10 para mantener una alta sensibilidad y una baja tasa de falsos positivos.Los contigs con superposiciones no ensambladas se fusionaron para formar contigs mt más largos utilizando el programa SeqMan implementado en el paquete de software Lasergene versión 7.1 [30].Usamos Bowtie2 [31] para la confirmación y/o extensión de los genomas mt.Los genes que codifican proteínas y los genes de ARNr de los genomas mt ensamblados se anotaron utilizando el programa Spin implementado en el paquete Staden [32].Los genomas mt anotados de estas garrapatas se depositaron en GenBank con los números de acceso OM368258—OM368330 y MK344649.Para inferir árboles filogenéticos, utilizamos 74 genomas mt generados en este estudio más 62 genomas mt de garrapatas de referencia adicionales obtenidos de GenBank.Se realizaron alineaciones individuales en cada uno de los genes codificadores de proteínas de 13 mt (ATP6, ATP8, COX1, COX2, COX3, CYTB, NAD1, NAD2, NAD3, NAD4, NAD4L, NAD5, NAD6) y dos genes de rRNA (12S rRNA y 16S rRNA ).Los genes que codifican proteínas se alinearon en función de los codones utilizando ClustalW implementado en MEGA versión 5.2 [33].Se eliminaron las regiones alineadas de forma ambigua.Se alinearon dos genes de ARNr utilizando MAFFT versión 7.4 [34] empleando el algoritmo L-INS-i con todas las regiones alineadas ambiguas eliminadas utilizando TrimAL versión 1.2rev59 [35].Luego se concatenaron los alineamientos de genes individuales para formar súper alineamientos para el análisis filogenético posterior.Estos comprendían: un (i) conjunto de datos de "todos los genes" que contenía 13 genes que codifican proteínas y dos genes de ARNr y (ii) un conjunto de datos de "un gen que codifica proteínas" que solo contenía los 13 genes que codifican proteínas.Todos los conjuntos de datos se analizaron utilizando algoritmos de máxima verosimilitud (ML) y bayesianos implementados en IQ-TREE versión 1.6.12 [36] y MrBayes versión 3.2 [37], respectivamente.Para los análisis de ML, se seleccionó el modelo de sustitución de nucleótidos que mejor se ajustaba mediante ModelFinder [38], y las topologías de árboles se evaluaron con un enfoque de aproximación de arranque ultrarrápido [39] con 1000 repeticiones.Para la inferencia del árbol bayesiano, usamos el modelo de sustitución como se describe anteriormente con 1 000 000 de generaciones en dos ejecuciones, y cada una se muestreó cada 500 generaciones con un quemado del 25 %.El perfil de taxonomía inicial fue realizado por metaphlan2 [40].Además, para cada biblioteca, buscamos la existencia de genes marcadores de Rickettsiales (groEL, gltA), Borrelia (groEL, bamA, flaB) y Coxiella (groEL, rpoB).Los contigs ensamblados se compararon con la base de datos de genes marcadores de referencia descargados de GenBank usando blastx, con un valor de corte de E establecido en 1E-10.Para las bibliotecas con cobertura de genes marcadores incompleta, las secuencias de genes parciales se obtuvieron mediante el mapeo de lecturas en una secuencia de genes marcadores de referencia de patógenos bacterianos utilizando Bowtie2 [31] y generando secuencias de consenso a partir de las lecturas mapeadas.Las lecturas limpias se asignaron posteriormente a las secuencias del gen groEL para estimar la abundancia de genes como el número de lecturas asignadas por millón de lecturas totales (RPM, RPM de un gen = Número de lecturas asignadas a un gen × 106/Número total de lecturas asignadas de una biblioteca dada ).Con base en estos genes, luego comparamos los patógenos bacterianos identificados en este estudio con los descritos anteriormente al estimar las relaciones filogenéticas utilizando los métodos ML y Bayesiano descritos anteriormente.Usamos el programa BaTS (Bayesian tip-association significant testing) [41] para probar si las bacterias patógenas (Rickettsia y Coxiella) forman una estrecha relación cofilogenética con sus garrapatas anfitrionas.Este análisis consideró las filogenias del huésped y del patógeno de la garrapata a nivel de género: es decir, Rhipicephalus, Hyalomma, Dermacentor, Amblyomma, Haemaphysalis, Ixodes, Argas y Carios.Específicamente, estimamos el índice de asociación [42] y lo comparamos con una distribución nula generada usando 1000 repeticiones de aleatorización estatal (es decir, géneros de garrapatas) en un conjunto creíble de árboles de patógenos generados por MrBayes versión 3.2 [37] como se describe anteriormente.Para examinar el alcance de la codivergencia entre bacterias y garrapatas, realizamos reconstrucciones cofilogenéticas basadas en eventos utilizando el programa Jane, versión 4.0 [43].El esquema de 'costo' para los análisis en Jane se estableció de la siguiente manera: co-divergencia = 0, duplicación = 1, cambio de host = 1, pérdida = 1, falta de divergencia = 1. Se establecieron tanto el número de generaciones como el tamaño de la población. a 100. La importancia de la co-divergencia se derivó al comparar los costos estimados con las distribuciones nulas calculadas a partir de 100 aleatorizaciones del mapeo de puntas de host.Además, realizamos un análisis basado en la distancia para probar la hipótesis de la codivergencia entre bacterias y garrapatas utilizando ParaFit tal como se implementa en el paquete de software COPYCAT versión 2.0 [44], comparando las matrices de distancia derivadas de las filogenias de las bacterias y las garrapatas.La prueba de significación se basó en 9999 aleatorizaciones de las matrices de asociación.Además, para visualizar la asociación entre las bacterias y sus garrapatas anfitrionas, se generó un tanglegrama haciendo coincidir cada especie bacteriana con sus garrapatas asociadas utilizando TreeMap versión 3.0beta [45].Las matrices de distancia genética de bacterias y garrapatas se derivaron de comparaciones genéticas por pares utilizando MEGA versión 5.2 [33].Las distancias geográficas (distancia euclidiana) se calcularon utilizando las coordenadas espaciales de las muestras derivadas de la información sobre su ubicación geográfica.Utilizamos el análisis de correlación de Mantel [46] para probar el alcance de la correlación entre estas matrices.Se realizó tanto una prueba de Mantel simple como una prueba de Mantel parcial, y la correlación se evaluó usando 10,000 permutaciones.Para acceder a cuál de los dos factores (distancias geográficas o genéticas de garrapatas) explicaba mejor la variación total en las matrices de distancia genética de bacterias, realizamos un análisis de regresión lineal múltiple [47] en estas matrices de distancia.La significación estadística de cada regresión se evaluó realizando 1000 permutaciones.Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete Ecodist implementado en R 3.4.4 [48], y todos los resultados estadísticos se consideraron significativos con un valor P de 0,05.Entre 1959 y 2019, se recolectaron más de 20 000 garrapatas de una amplia variedad de huéspedes (p. ej., bovinos, caprinos, camellos, erizos) en toda China (Fig. 1, Tabla 1, Archivo adicional 1: Tabla S1).La identificación de especies de garrapatas duras se realizó con base en caracteres morfológicos, tales como palpos, base capituli, cuernos, aurículas, fórmula de dentición, puntuaciones, espolones coxales, entre otros [49,50,51].La identificación de las garrapatas blandas se realizó utilizando las claves taxonómicas propuestas por Hoogstraal [54], Teng [50] y Sun et al.[52,53,54].Esto reveló un total de al menos 46 especies que comprenden dos familias (Ixodidae y Argasidae) y ocho géneros: Haemaphysalis (19), Ixodes (10), Dermacentor (seis), Rhipicephalus (cuatro), Hyalomma (dos), Amblyomma (tres) , Argas (uno) y Carios (uno).Entre estos géneros se encuentran las seis especies de garrapatas más comunes en China [6]: R. microplus, R. sanguineus sl, I. persulcatus, Hae.longicornis, D. silvarum y Hyalomma asiaticum.Además, se recolectaron y analizaron otras especies comunes, como I. sinensis (vector de B. burgdorferi [55]), Ixodes ovatus, D. steini, Haemaphysalis yeni, Hae.concinna, Hyalomma scupense, Rhipicephalus turanicus, Rhipicephalus haemaphysaloides y Argas persicus de al menos dos provincias.En comparación, otras especies se definieron más localmente, como Hae.tibetensis del Tíbet, Hae.qinghaiensis y Haemaphysalis danieli de Qinghai, Hy.asiaticum, Haemaphysalis punctata, Dermacentor marginatus y Dermacentor niveus de Xinjiang, Ixodes acutitarsus de Hubei y Haemaphysalis lagrangei y Haemaphysalis mageshimaensis de Hainan.Además, obtuvimos varias especies muy raras, en particular Amblyomma javanense, Ixodes simplex, Ixodes nuttallianus, Ixodes crenulatus, Ixodes kuntzi, Haemaphysali kitaokai y Carios vespertilionis, algunas de las cuales se recolectaron de animales silvestres, incluidos murciélagos, pangolines y ardillas voladoras ( Pteromyini).Otras muestras se recogieron mediante métodos de marcado por arrastre o eran muestras históricas conservadas en etanol durante más de 60 años.Por ejemplo, la muestra más antigua de nuestro conjunto de datos (A. javanense) se recolectó en la década de 1960 de un pangolín chino salvaje (Manis pentadactyla).En el caso de dos muestras (es decir, C20, A29), la identificación solo pudo tener lugar a nivel de género, en Amblyomma e Ixodes, respectivamente.Dado que no pudimos identificarlos a nivel de especie usando características morfológicas, fueron asignados tentativamente como nuevas especies potenciales.Secuenciamos el ADN total de 96 muestras de garrapatas individuales o mixtas, lo que generó un promedio de 7,87 Gb de lecturas limpias para el ensamblaje y la anotación de novo.Se obtuvieron con éxito secuencias completas o casi completas del genoma mt de 74 de las 96 bibliotecas, incluidas 23 especies cuyos genomas mt se informaron por primera vez.La longitud de los genomas mt recién identificados osciló entre 14 428 pb y 15 307 pb, y el contenido de AT varió del 72,29 % (Ixodes sp. A29) al 81,06 % (Hae. danieli Z14), similar a los genomas mt de garrapatas previamente identificados [9 ].Además, la estructura, composición y disposición de los genes siguió en gran medida a sus parientes más cercanos dentro del mismo género [9, 56].Las únicas diferencias se observaron en la longitud y la composición de las regiones no codificantes, algunas de las cuales contienen más de una región repetida en tándem (Archivo adicional 1: Fig. S1–S2, Tabla S2).Por ejemplo, el genoma mt de D. marginatus E48 tiene una copia adicional de la región no codificante, por lo que su longitud (es decir, 15 307 pb) ha superado la de Ixodes tasmani (NC 041 086,1, 15 227 pb) [9] para convertirse en el más largo tick mt genoma identificado hasta la fecha (Archivo adicional 1: Fig. S1).Además, encontramos inconsistencias en la región de control dentro de algunas muestras individuales.Por ejemplo, la clonación de la secuenciación de productos de PCR que abarcan la región de control entre trnQ y trnF revela varios números de copias de secuencias repetidas cortas dentro de la misma muestra (una sola garrapata, D. marginatus E1) (Archivo adicional 1: Fig. S2C).Tanto los árboles filogenéticos bayesianos como los de máxima verosimilitud se estimaron en base a secuencias de 13 genes codificadores de proteínas y dos genes de ARNr derivados de 136 genomas de garrapatas, incluidos 74 generados en este estudio y 62 genomas de referencia de GenBank.Los métodos ML y bayesiano dieron como resultado topologías de árboles muy similares que colocaron la diversidad de marcas chinas dentro de un contexto global con alta resolución (Fig. 2, Archivo adicional 1: Fig. S3–S6).Es importante destacar que los genomas recién agregados ampliaron en gran medida la diversidad de muchos grupos, en particular los géneros Haemaphysalis, Ixodes y Dermacentor (Fig. 2).Además de las nuevas especies identificadas en este estudio, también se incluyeron 23 especies de garrapatas que anteriormente solo se conocían a través de características morfológicas o genomas mt incompletos (p. ej., I. kuntzi, I. acutitarsus, Hae. mageshimaensis y Haemaphysalis colasbelcouri) (Fig. 2, Adicional archivo 1: Fig. S3–S6).Además, se identificaron al menos cinco especies crípticas potenciales: R.sanguineus sl, D. steini, D. marginatus e I. ovatus, que se suman a las especies crípticas previamente reportadas identificadas en R. microplus [6, 57].Cada uno contenía al menos dos grupos filogenéticos divergentes (70,93-94,21% de identidad) mientras compartía las mismas características morfológicas basadas en palpos, capítulos básicos, forma y ornamentación en scutum, espolones en coxae I-IV, syncoxae y ala, etc., aunque más las características morfológicas necesitan ser examinadas para confirmar esta observación (Fig. 2).Por el contrario, D. sinicus, Dermacentor nuttalli y D. silvarum compartían una relación muy estrecha (> 98,46 % de identidad) a pesar de que se trataba de especies separadas según sus características morfológicas.Curiosamente, D. nuttalli y D. silvarum no se pueden distinguir en función de la filogenia del genoma mt, aunque tenían un espolón dorsal del trocánter I bastante distintivo (Archivo adicional 1: Fig. S7).Filogenias de ML de garrapatas basadas en los 13 genes codificantes de proteínas y dos genes de ARNr.Dos especies de ácaros actúan como grupo externo y la barra de escala representa el número de sustituciones de nucleótidos por sitio.Para mayor claridad, los valores de arranque solo se muestran para los nodos principales.El árbol filogenético central se muestra a la izquierda, y las secuencias generadas en este estudio están marcadas con un círculo y coloreadas según los diferentes géneros de garrapatas.Los subárboles detallados de cada grupo se muestran a la derecha.Dentro de cada subárbol, las secuencias recién identificadas aquí están marcadas y coloreadas en consecuencia junto con el número de bibliotecas de secuenciación.Primero usamos metaphlan2 [40] para el perfil taxonómico bacteriano, que reveló la presencia de> 32 géneros, incluidos Acinetobacter, Pseudomonas, Helicobacter y Escherichia (Archivo adicional 1: Fig. S8).Entre estos, identificamos bacterias endosimbióticas de garrapatas o bacterias que se sabe que albergan patógenos humanos: a saber, el orden Rickettsiales, género Coxiella y género Borrelia.Estos descubrimientos se confirmaron y caracterizaron aún más con el análisis de los genes marcadores (Fig. 3A).En general, el 56 % (54/96) de las bibliotecas de garrapatas fueron positivas para estos grupos bacterianos, entre los cuales Coxiella tuvo la prevalencia más alta (40/96, 42 %), seguida de Rickettsia (26/96, 27 %), Wolbachia (1 /96, 1%) y Borrelia (1/96, 1%) (Fig. 3A, Archivo adicional 1: Tabla S3).La abundancia de grupos bacterianos asociados a garrapatas según el gen groEL y la proporción de bibliotecas positivas de cada grupo;Rickettsiales (NA) representó bacterias identificadas que no pudieron clasificarse en un género específico (A).Árboles filogenéticos para bacterias del orden Rickettsiales basados ​​en el gen groEL (B), géneros Coxiella basados ​​en el gen groEL (C) y Borrelia basados ​​en el gen flaB (D).Los árboles tenían raíces en el punto medio y la barra de escala representa el número de sustituciones de nucleótidos por sitio.Secuencias generadas en este estudio marcadas por un círculo y coloreadas según diferentes géneros de garrapatas.Los valores de Bootstrap solo se muestran para los nodos principales.Dentro de la filogenia de Rickettsiales, los diferentes géneros se indican mediante líneas verticales.Dentro de la filogenia de Coxiella, la posición de C. bernetii está resaltada por una flecha negra.Dentro de la filogenia de Borrelia, "RF" denota el grupo de fiebre recurrente, "REB" denota la Borrelia asociada a reptiles y echnida, mientras que "LB" indica el grupo de borreliosis de Lyme [69]La mayoría de las especies del orden Rickettsiales pertenecían al género Rickettsia, dentro del cual se identificaron 14 especies bacterianas de todos los géneros de garrapatas incluidos en este estudio (con la excepción de Hyalomma; Fig. 3B), incluidos varios patógenos humanos.Por ejemplo, Rickettsia raoultii, que causa la linfadenitis humana transmitida por garrapatas [58, 59], se identificó a partir de D. marginatus y D. niveus en Jinghe, provincia de Xinjiang, una región donde R. raoultii se ha informado previamente [60,61, 62].Dentro de Xinjiang (Jinghe y Yining), identificamos Rickettsia sibirica y Rickettsia africae circulando en D. sinicus e Ixodes vespertilionis, que son responsables de una variedad de enfermedades transmitidas por garrapatas, incluido el tifus siberiano por garrapatas (STT) en Asia y la fiebre por picadura de garrapata africana. (ATBF) en África [20].Además, descubrimos Rickettsia heilongjiangensis, el agente recientemente informado de la fiebre maculosa del Lejano Oriente (FESF) [63].Esta bacteria se encontró previamente en las garrapatas D. silvarum de Heilongjiang, y aquí se asoció con las especies de garrapatas Haemaphysalis campanulata y Haemaphysalis cornigera en las provincias de Hubei y Jiangxi ubicadas en el centro de China.Otras especies patógenas de Rickettsia incluyeron Rickettsia tamurae, Rickettsia monacensis y Rickettsia helvetica identificadas en Amblyomma testudinarium, I. sinensis e I. kuntzi.Encontramos una especie potencialmente nueva dentro del Grupo de fiebre maculosa que era relativamente divergente (< 99,46 % de identidad genética en seis genes) de las otras bacterias de este grupo (Archivo adicional 1: Tabla S4).Dado que la especie se identificó a partir de Haemaphysalis megaspinosa, tentativamente la llamamos Rickettsia endosimbionte de Haemaphysalis megaspinosa.Además, identificamos cuatro especies de Rickettsia genéticamente divergentes que ocupaban posiciones filogenéticas basales.Entre estos, Rickettsia endosimbionte de Ixodes persulcatus H5 y N2 agrupados con Rickettsia canadensis (97,78% de identidad), Rickettsia endosimbionte de Argas persicus H1 cayó con Rickettsia bellii y Rickettsia sp.MEAM1 (Bemisia tabaci) (92,16 % y 90,96 % de identidad) y Rickettsia endosimbionte de Ixodes vespertilionis A54b, Rickettsia endosimbionte de Carios vespertilionis X1 formaron un grupo monofilético con Rickettsia endosimbionte de Culicoides newsteadi a pesar de un alto nivel de divergencia (86,08 % y 85,97 % identidad, respectivamente) (Archivo adicional 1: Tabla S4, Fig. S9–S11).Además de Rickettsia, identificamos dos nuevas especies potenciales dentro del orden Rickettsiales.Uno, Wolbachia endosimbionte de Ixodes vespertilionis A54, agrupado con Wolbachia pipientis cepa FL2016 (95,37 %) y Wolbahcia endosimbionte de Drosophila melanogaster (95,16 %) dentro del género Wolbachia.La identificación de Wolbachia en garrapatas se ha informado en los últimos años [64, 65].El otro, Rickettsiales endosimbionte de Dermacentor, se agrupó con una bacteria Rickettsiales Ac37b no clasificada identificada en Amblyomma cajennense en Brasil (86,62% de identidad).Juntos pueden representar un nuevo género o incluso una familia dentro de Rickettsiales (Archivo adicional 1: Tabla S4, Fig. S9–S10).Las bacterias del género Coxiella tuvieron la mayor prevalencia entre las especies de garrapatas examinadas (40/96, 42%).Las especies de Coxiella recién descubiertas en el presente estudio son muy diversas y amplían enormemente la diversidad genética dentro de este grupo (Fig. 3C).De hecho, se definieron nuevos linajes genéticos basados ​​en nuestro análisis filogenético, incluido el endosimbionte Coxiella de Dermacentor marginatus, el endosimbionte Coxiella de Haemaphysalis concinna y el endosimbionte Coxiella de Ixodes ovatus, la mayoría de los cuales eran divergentes de los miembros existentes de Coxiella y generalmente asociados con géneros de garrapatas (Fig. 3C, archivo adicional 1: Fig. S12).Coxiella burnetii, el agente causante de la fiebre Q [66], se ha informado de la garrapata D. sinicus muestreada en la provincia de Xinjiang y estaba estrechamente relacionada con la cepa "Dugway 5J108-111" muestreada en los EE. UU. [67] (Fig. 3C, Archivo adicional 1: Fig. S11).Además de C. burnetii, identificamos una sola especie de Borrelia de una garrapata blanda Carios vesperitilionis en la provincia de Henan.Con base en los análisis filogenéticos, la bacteria recientemente identificada, llamada Borrelia henanensis X1, cayó dentro de un clado "RF" que contiene patógenos que causan fiebre recurrente transmitida por garrapatas (Fig. 3D, Archivo adicional 1: Fig. S13) [68, 69] .Usamos las pruebas de Mantel para examinar si el huésped de la garrapata y/o los factores geográficos dan forma a la diversidad genética de las bacterias que portan.Tanto para Rickettsia como para Coxiella, nuestros resultados revelaron correlaciones positivas y significativas (P < 0,0005) entre las matrices de distancia genética de garrapatas y bacterias.Sin embargo, no se encontró una correlación tan significativa entre la distancia genética bacteriana y la distancia geográfica.Se obtuvieron resultados similares utilizando (i) análisis parciales de Mantel, en los que probamos el efecto entre dos factores mientras controlamos el tercero, y (ii) análisis de regresión lineal múltiple en los que probamos el efecto entre tres matrices (Tabla 2, Archivo adicional 1: Tabla S5).Estos resultados sugirieron que la diversidad genética bacteriana estaba determinada principalmente por la distancia genética de las garrapatas, y que la distribución geográfica tenía poco o ningún impacto.El fuerte impacto de la garrapata en la diversidad genética bacteriana también se reflejó en el análisis filogenético en el que observamos un agrupamiento significativo de diversidad genética bacteriana a nivel general de garrapatas [Rickettsia: índice de asociación (IA) = 2,760, P < 0,001;Coxiella: IA = 0,969, P < 0,001].A continuación, examinamos si la filogenia de las garrapatas y sus simbiontes bacterianos exhibían un patrón de codivergencia entre bacterias y garrapatas a lo largo del tiempo evolutivo.Primero probamos la hipótesis de la co-divergencia utilizando un marco basado en eventos, en base al cual reconciliamos las filogenias de las garrapatas y sus bacterias asociadas (es decir, Rickettsia y Coxiella, respectivamente) al tener en cuenta cuatro procesos: co-divergencia, duplicación, cambio de huésped. y pérdida [43].Esto reveló significativamente menos eventos de no codivergencia (es decir, duplicación, cambio de host y pérdida) de lo esperado solo por casualidad.De manera similar, examinamos la hipótesis de la co-divergencia utilizando un método de distancia, en el que evaluamos la congruencia filogenética general comparando la distancia patrística de los simbiontes de garrapatas y bacterias [44].Esto confirmó la similitud general significativa (ParafitGlobal, P = 0,0021 y 0,0003, respectivamente, para Rickettsia y Coxiella, en 9999 permutaciones) entre las filogenias de simbiontes de garrapatas y bacterias (Fig. 4).En conjunto, estos resultados sugieren que las bacterias simbióticas de los géneros Rickettsia y Coxiella han divergido conjuntamente con sus anfitriones de garrapatas durante al menos 264 millones de años.Comparaciones co-filogenéticas de las filogenias de las bacterias Rickettsia y Coxiella y sus correspondientes garrapatas hospedadoras.La tabla muestra los resultados del análisis de cofilogenia utilizando Parafit y Jane4.El tanglegrama muestra la coincidencia entre las filogenias de las bacterias y las garrapatas anfitrionas.La relación entre las dos filogenias se muestra para maximizar la congruencia topológica.Los colores de la línea punteada corresponden a diferentes grupos de marcas, como se muestra en la leyenda de la figura en la parte inferior derechaRecolectamos > 20 000 garrapatas y determinamos los genomas mitocondriales de al menos 46 especies que representan la diversidad de garrapatas comunes y raras en China.Nuestro muestreo cubrió principalmente áreas residenciales humanas, así como algunos puntos críticos de biodiversidad, a saber, el bosque Shennongjia (provincia de Hubei), la meseta del Tíbet (provincias del Tíbet y Qinghai) y la pradera de Hulun Beir (Mongolia Interior).Si bien la mayoría de las garrapatas se tomaron muestras de animales domésticos y eran comunes [6], las identificadas en la vida silvestre o directamente del medio ambiente produjeron una diversidad más única.Por lo tanto, puede haber muchas más especies de garrapatas en China que aún no han sido identificadas por los esquemas actuales de muestreo de enfermedades o centrados en humanos.De hecho, varias especies de garrapatas, como I. kuntzi y Hae.colasbelcouri identificados en Taiwán y Laos [70, 71], no han sido secuenciados ni caracterizados previamente.Además, existe una falta general de vigilancia genómica de las garrapatas en reptiles y anfibios, de modo que quedan lagunas evolutivas sustanciales en el estudio de la relación garrapata-bacteria a largo plazo.Nuestro estudio infirió la historia evolutiva de las garrapatas en función de los conjuntos completos de genes mitocondriales, lo que reveló un árbol filogenético bien respaldado que resuelve las relaciones entre especies de garrapatas con alta resolución (Fig. 2).Subunidad II del citocromo c oxidasaNat Comun.Ámsterdam: Elsevier;2019. pág.Más uno.Arch Insect Biochem Physiol.Datos de ciencia.Célula.Dordrecht: Springer;2014.Parasitología.Vectores de parásitos.J Mol Evol.J Mol Evol.Fiebre con trombocitopenia asociada con un nuevo bunyavirus en China.N Engl J Med.N Engl J Med.EBioMedicine.Vectores de parásitos.Walker DH, Ismail N. Rickettsiosis emergentes y reemergentes: infección de células endoteliales y eventos tempranos de la enfermedad.Nat Rev Microbiol.Actualización sobre las rickettsiosis transmitidas por garrapatas en todo el mundo: un enfoque geográfico.BMC Salud Pública.Más uno.Espectro de Microbiol.Aplicación Environ Microbiol.Nat Rev. Genet.Mol Ecol.Li D, Liu CM, Luo R, Sadakane K, Lam TW.MEGAHIT: una solución ultrarrápida de un solo nodo para ensamblaje metagenómico grande y complejo a través de un gráfico de Bruijn sucinto.Bioinformática.Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ.Herramienta básica de búsqueda de alineación local.J Mol Biol.Mol Biotechnol.Ácidos Nucleicos Res.Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: análisis de genética evolutiva molecular utilizando métodos de máxima verosimilitud, distancia evolutiva y máxima parsimonia.Mol Biol Evol.2011;28:2731–9.Mol Biol Evol.Bioinformática.Mol Biol Evol.Bioinformática.Métodos Nat.Mol Biol Evol.Métodos Nat.Infect Genet Evol.J Virol.Bioinformática.Mol Biol Evol.Cáncer Res.Software J Stat.Beijing: Editorial Médica Popular;mil novecientos ochenta y dos.1991.Cham: Springer;2018.Vectores de parásitos.Mol Biol Evol.Vectores de parásitos.Emergente Infect Dis.Vectores de parásitos.BMC Infect Dis.Exp Appl Acarol.Emergente Infect Dis.Microorganismos.Exp Appl Acarol.BMC Genómica.Inmunidad a infeccionesAnuncio del genoma.Más uno.J Med Entomol.Enfermedades zoonóticas transmitidas por vectores.BMC Evol Biol.Mol Gen Mikrobiol Virusol.Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.Los autores declaran no tener conflictos de intereses.Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.Figura S1.Figura S2.Tabla S2.Figura S3.Figura S4.Figura S6.Figura S8.Tabla S3.Tabla S4.Figura S11.Figura S12.Tabla S5.Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material.Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedItParte de la naturaleza de Springer.